論文已發(fā)表在《發(fā)酵科技通訊》2022年4期

論單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用

              公維麗1，2，劉仲匯1，2，馬耀宏1，2，史建國(guó)1，2
        (1．齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)  生物研究所，山東 濟(jì)南 250014；

2．山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：發(fā)酵尾氣分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)的應(yīng)用已逐漸展開(kāi)，但人們對(duì)單通道檢測(cè)的認(rèn)識(shí)依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過(guò)程的“實(shí)時(shí)性”以及發(fā)酵過(guò)程的“臨界點(diǎn)”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應(yīng)采用實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線檢測(cè)；通過(guò)以尾氣分析獲得的“臨界點(diǎn)”在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(指 導(dǎo)轉(zhuǎn)速調(diào)整、流加補(bǔ)料、乳糖誘導(dǎo)及處理異常發(fā)酵)，進(jìn)一步闡明只有單通道檢測(cè)才能真正做到檢測(cè) 的實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線，捕捉到有價(jià)值的“臨界點(diǎn)”信息。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測(cè)
中圖分類(lèi)號(hào)：Q819                   文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A                        文章編號(hào)：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas analysis
GONG Weili1，2，  LIU Zhonghui1，2，  MA Yaohong1，2，  SHI Jianguo1，2
        (1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)，  Biology Institute，Jinan 250014，  China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014，  China)

Abstract：  The  technology  of  fermentation  tail  gas  analysis  has  been  gradually  developed  and applied in the industry，  but single－channel detection is still poorly understood．  In this paper， we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection         from the significance of fermentation tail gas analysis，  the “real－time”of biological process，  and         the critical  point  of  fermentation  tail  gas  analysis  curve  reflecting  the  change  information  of process state，  and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering                 (guidance  of  speed  adjustment，   flow  feeding，   lactose  induction  and  treatment  of  abnormal         fermentation)  illustrated that only single channel detection can achieve real－time，  continuous and online detection，  and capture valuable “critical point”information．
Keywords：  fermentation；  tail gas analysis；  single channel；  detection

收稿日期：2022－09－01
基金項(xiàng)目：齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)融合試點(diǎn)工程基礎(chǔ)研究類(lèi)基金資助項(xiàng)目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)(2022JBZ01－06)； 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (重大關(guān)鍵技術(shù))(2016ZDJS07A20)
作者簡(jiǎn)介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副 研 究 員，研究方向?yàn)樯飩鞲衅骷夹g(shù) 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級(jí)工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。

發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過(guò)程中在線檢測(cè)尾氣中 的 CO2   和 O2   的體 積 分 數(shù)，計(jì) 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2   釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細(xì)胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過(guò)程分析技術(shù)(Process analysis technology， PAT)。  無(wú)論 是 在 微 生 物 生 長(zhǎng) 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長(zhǎng) 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關(guān) 。  OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營(yíng) 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長(zhǎng) 速 率 以 及 碳 源 的 種 類(lèi) 和 濃 度 等 因 素 有 關(guān) 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過(guò)程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長(zhǎng) 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1－7]  。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分 析，可 以 更好地對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè) 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過(guò) 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測(cè) 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過(guò) 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學(xué)意義 。尾氣分析時(shí)僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結(jié) 構(gòu)，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無(wú) 染 菌 風(fēng) 險(xiǎn)[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領(lǐng)域 。  雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用，但是由于歷 史原因以及設(shè)備成本等因素的影響，對(duì)檢測(cè)設(shè)備是否 需要采用獨(dú)立的單 通 道，認(rèn) 識(shí) 依 舊 模 糊 。  因 此，筆 者 從理論與實(shí)際應(yīng)用兩方面對(duì)該問(wèn)題加以分析探討 。
1    發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實(shí)時(shí)連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過(guò) 程 中，微 生 物 生 長(zhǎng) 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對(duì)數(shù)生 長(zhǎng) 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11]  。  常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時(shí)至數(shù)天 。在看似較 長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 往往發(fā)生在很短 的時(shí)間內(nèi)，某些代謝變化可能用時(shí)更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過(guò) 程 優(yōu) 化》[12]  及 相 關(guān)論 文[13]   中 詳細(xì)闡述了生 物 過(guò) 程 的 “實(shí) 時(shí) 性 ”： 1)  從生物 過(guò)程發(fā)生的時(shí) 間以及 生物技術(shù)發(fā)展特點(diǎn) 來(lái)看，對(duì)于以活細(xì) 胞為主體的細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應(yīng)過(guò)程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生 的；2)  可將微 生 物 和 細(xì) 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價(jià)修飾和降 解) 控制的時(shí)間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達(dá)調(diào)控水平上(誘 導(dǎo) 、轉(zhuǎn) 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 ?？疾煳?生 物 和 細(xì) 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時(shí)間尺 度 上 是 合 適 的 。   因 此，作 為 動(dòng) 態(tài) 觀 測(cè) 記錄細(xì)胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設(shè) 備，應(yīng) 對(duì) 排 出 的尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，只有這樣，才能準(zhǔn)確 捕捉到發(fā)酵過(guò)程中代謝的改變 。

2    合理利用發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
2．1    發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
李強(qiáng)等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過(guò)青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個(gè)體系的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)分析，對(duì) CER 的變化規(guī)律進(jìn)行了探 究，研 究 結(jié) 果 表 明：無(wú) 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細(xì) 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉(zhuǎn) 折 點(diǎn) 對(duì) 應(yīng) 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點(diǎn) 。   由該文獻(xiàn)的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉(zhuǎn)折點(diǎn)處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉(zhuǎn) 為 降，或者由降轉(zhuǎn)為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過(guò)程中還存在另一類(lèi)極具價(jià)值 的 變 化 點(diǎn)，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉(zhuǎn)為緩慢的時(shí)間點(diǎn)，比如在微生物生長(zhǎng)由遲緩期進(jìn) 入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進(jìn)入衰亡期的那些時(shí)間點(diǎn)上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類(lèi)時(shí)間點(diǎn)上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒(méi)有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說(shuō)發(fā)生了從一個(gè) 發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個(gè)發(fā)酵階段 。這類(lèi)變化點(diǎn)在發(fā) 酵過(guò)程中普遍存在，不僅有著明確的生物學(xué)意義，而 且具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值 。可將發(fā)酵過(guò)程中這類(lèi) 變化速率顯著改變 的 點(diǎn)，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn) 折點(diǎn)統(tǒng)稱(chēng)為臨界變化點(diǎn)，簡(jiǎn)稱(chēng)“臨界點(diǎn)”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個(gè)狀態(tài)到另一個(gè)狀態(tài)的改變，亦 或從一個(gè)階段到另一個(gè)階段的改變 。
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù) 在 線 監(jiān) 測(cè)，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn) 。這些 臨界點(diǎn)提供的豐富信息可以幫助人們辨識(shí)發(fā)酵過(guò)程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉(zhuǎn) 速／通 氣 量 、流 加 補(bǔ) 料 、基 因 誘 導(dǎo)，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導(dǎo)，同時(shí)也為工藝放大提供對(duì)比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點(diǎn)信息對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2    利用發(fā)酵過(guò)程臨界點(diǎn)指導(dǎo)操作
2．2．1    利用臨界點(diǎn)調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過(guò)程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。  如何適時(shí)調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達(dá)到***適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關(guān)鍵點(diǎn)之一[15－17]  。  一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結(jié)果等進(jìn)行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點(diǎn)，則可以準(zhǔn)確把握調(diào)整時(shí)機(jī) 。
在山東省科學(xué) 院 生 物 研 究 所 承 擔(dān) 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點(diǎn)研 發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2016ZDJS07A20) 項(xiàng) 目 中，在 10L 實(shí) 驗(yàn) 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對(duì) 重 組 畢 赤酵母表達(dá)植酸酶過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè) 。  發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉(zhuǎn)速 200r／min 。  發(fā)酵 6h5min 時(shí)，CER 開(kāi) 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時(shí)，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點(diǎn)，預(yù)示發(fā) 酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，此時(shí) 立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達(dá) 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30  min，之 后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結(jié) 束 。  該 發(fā) 酵 過(guò) 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過(guò)程中，發(fā) 酵 15h 時(shí) 進(jìn) 行 甲醇誘導(dǎo)，誘 導(dǎo) 5h 后 開(kāi) 啟 蛋 白 表 達(dá)，SDS－PAGE 檢 測(cè)植酸酶表達(dá)見(jiàn)文獻(xiàn)[18]，***終酶活達(dá) 3 000U／mL。

相關(guān)附件：論單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用.pdf